黄粉虫对幼刺参生长、消化和免疫力的影响

刺参是中国海产经济资源的重要海珍品， 目前随着养殖规模的不断增大， 出现了成参免疫力下降、幼参生长慢和成活率低等一些问题，严重制约了刺参养殖业的发展。而黄粉虫幼虫粉不仅蛋白质含量高，而且脂肪和各种微量元素也很丰富，尤其是含有甲壳素和天然抗菌肽等物质对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和猪链球菌等具有较强的抑制作用，且黄粉虫具有饲养投资小、食性杂、抗病力强、生长周期短和随时随地即可养殖等优点，有效地弥补了鱼粉的缺乏。因此将黄粉虫粉作为新型的具有免疫增强效果的饲料添加剂对从根本上提高刺参免疫力、降低生产成本、减少病害和经济损失及促进刺参养殖业可持续发展具有重大的现实意义。

据研究，在畜禽饲料中添加一定量的黄粉虫粉能显著提高动物的生产性能及健康水平，而将黄粉虫粉作为饲料添加剂或鱼粉的替代物应用于刺参养殖的饲喂效果目前罕有报道，尤其是黄粉虫粉对刺参免疫酶与消化酶活性的影响尚未见研究。试验尝试在幼刺参饲料中用黄粉虫粉替代鱼粉，通过观测淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)与溶菌酶(LSZ)的活性等评价指标，初步研究黄粉虫粉对幼刺参生长性能、消化功能与免疫机能的影响，旨在为黄粉虫粉在刺参健康生态养殖中的合理应用提供科学依据。

参考行情：海参市场行情

一、材料与方法

1、饲料的制作

用马尾藻、鼠尾藻、海泥、豆粕、小麦粉、谷物调和鱼油、优质鱼粉及刺参专用复合多维制成粗蛋白含量为18．60％ 的均匀粉末状基础饲料，所有饲料原料均通过80目标准筛。在等氮的基础上将黄粉虫粉以20％、4O％ 、60％和80％的比例代替基础饲料中的鱼粉，制成4种试验饲料。黄粉虫幼虫购自锦州市花鸟鱼虫市场，于7O℃烘干研粉备用。5种试验饲料配方见表1。

2、饲养试验

试验用幼刺参取白辽宁省锦州市金域刺参良种场，将225头质量(平均体质量为2.62 g)和大小相似的健康幼参随机均匀放人15个(试验饲料即为5种处理，每处理设3个重复)塑料整理箱中(50cmX40cmX30cm)，每箱养15头参，每箱放12L水。

试验在辽宁医学院畜牧兽医学院水产养殖实验室进行，试验期为30天，2012年3月11日-4月9日。

养殖刺参所用海水为渤海锦州湾自然海水，经沉淀后使用。刺参培养采用自然水温，养殖期间温度从12℃逐渐上升到15℃。刺参养殖室为东西向，半透明窗帘外挂聚乙烯遮阳网，每天下午13:30吸底1次，换水量为总水量的1/2，每天24小时充气，每10天彻底清底处理。每天吸底后1次过量投喂饲料，投饲量为体质量的2.5％，粉状饲料入水后搅匀。海水盐度为28‰～31‰，PH8.0-8.4，溶解氧为6.6～7.5 mg/L，NH4+<0.2 mg/L。

黄粉虫养殖知识：黄粉虫养殖

3、试验测定指标

①生长指标

试验期间，每10天测定各试验组刺参体质量，同时记录生活状态和存活个体数，在试验的前1天与最后1天各停食1天后将每个水槽中刺参全部称质量，称量时将刺参过滤到筛绢网中并在于滤纸上停留30S，测其质量，分析天平感量为0.01g。计算特殊生长率(SGR)：

式中：M0为放养时刺参的头数，MT为结束时刺参的头数。

②刺参消化酶的测定

（1）粗酶液提取

试验结束后，从每处理组的3个水槽中挑选健康、活力强且个头大的9～10头幼刺参装人密封袋内，放入-7O℃冰柜中冷冻备用。测定刺参消化酶活性时将刺参在冰水中解冻，沿刺参腹部用剪刀剪开，在冰盘上取出完整的消化道，剔除呼吸树和肠系膜上的脂肪组织并清除肠内粪便(注意：要保留刺参肠道内的淡粉色分泌物)，用滤纸吸f肠表晰

的水分，把多头刺参的肠道合并为一个样本，称质量后，置于玻璃匀浆器中，并加入0-4℃预冷的肠道组织10倍质量的0.02mol/L PH 7.5磷酸缓冲液，在冰浴中充分匀浆后，将匀浆液髓于高速冷冻离心机中(0～4℃，12000r/min)离心20min，所得上清液即为粗酶液，将其置于冰水中贮存，24小时内测定完毕。

（2）消化酶活性的测定

蛋白酶活性测定采用福林一酚法测定，在37℃每分钟水解酪素产生1μg酪氨酸为1个酶活力单位；淀粉酶活性采用淀粉一碘比色法测定，在37℃，30min内，100mL酶液中的淀粉酶能完全水解淀粉10mg时称为1个淀粉酶活力单位；纤维素酶活性采用3，5-二硝基水杨酸法测定，以40℃下刺参肠道纤维素酶每分钟催化纤维素生成1mg葡萄糖作为1个酶活力单位；采用聚乙烯醇橄榄油乳化液水解法测定刺参脂肪酶活性，脂肪酶活力以在PH 7.5和40℃条件下，脂肪酶水解脂肪何分钟产生1μmol肪酸的酶量定为1个活性单位。所有消化酶活力均用比活力(U/g蛋白质，即所用的粗酶液中每克酶蛋白活力的国际单位)表示，酶蛋白含量的测定采用南京建成生物工程研究所考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒进行。

③刺参免疫指标测定

（1）刺参组织匀浆上清液的制备

饲养试验结束后，从每处理的3个水槽中挑选健康且活力强的5～6头刺参装入密封袋内放入-70℃冰柜中冷冻备用。测定刺参免疫酶活性时将刺参在冰水中解冻，用滤纸吸干其表面水分后称质量，用剪刀将整个刺参剪碎，置于玻璃匀浆器中，并加入0～4℃预冷的刺参组织1倍质量的氯化钠注射液，在冰浴中充分匀浆后，将匀浆液置于高速冷冻离心机中(0-4℃，12000r/min)离心20min，所得上清液置于冰水中，用其来测定刺参的ACP、AKP、T-SOD和LSZ活性，24小时内测定完毕。

（2）免疫酶活性的测定

LSZ、ACP、AKP和T—SOD的测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

LSZ活力的测定：采用自身对照法进行测定，刺参组织匀浆上清液取样量为0.2mL，在可见分光光度计530nm处，测反应样品的透光率，酶活力计算公式为：

LSZ含量(U/mL) = {(测定管透光度uT-测定管透光度UT。)/(标准管透光度ST2-标准管透光度STn)} X标准管质量浓度(80U/mL) X样本测试前稀释倍数(2倍)

T-SOD活力的测定：刺参组织匀浆上清液取样量为10 ，组织匀浆中T-SOD活力定义为每毫克组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50％时所对应的超氧化物歧化酶(SOD)量为一个SOD活力单位(u)，计算公式：

T-SOD活力(U/mg蛋白) = [(对照管吸光度一测定管吸光度)/对照管吸光度]×(反应液总体积/取样量)/(待测样本蛋白质量浓度×50％)ACP与AKP活力完全按照试剂盒说明书组织匀浆中ACP与AKP的测定方法进行测定与计算。

刺参组织匀浆上清液中蛋白质量浓度的测定：采用南京建成生物工程研究所考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒进行测定。取刺参组织匀浆上清液l0μL，加入氯化钠注射液4OμL(此时稀释5倍)，即为稀释10倍的刺参组织匀浆待测样品(注：在制备上清液时已稀释2倍)。

蛋白质量浓度计算公式：蛋白质量浓度(g/L)={(测定管OD值一空白管OD值)/(标准管OD值-空白管OD值)}×标准管质量浓度(0.563g/L)×组织样品稀释倍数(10倍)。

4、数据处理

数据均以平均值±标准差表示，经SPSS 10.0统计软件分析进行单因素方差分析，并用Duncan氏新复极差法(SSR法)比较各组间平均值的差异显著性。

二、结果与分析

1、添加黄粉虫粉对刺参生长和成活的影响从表2可见：经过30天的饲养试验，黄粉虫粉各试验组刺参的SGR均显著高于对照组，20％组、40％组、60％组和80％组的幼参SGR分别比对照组高25.76％、56.99％、111.30％和186.72％；随着黄粉虫粉替代量的递增，刺参的SGR和SR都逐渐升高，且黄粉虫粉替代鱼粉各组间的SGR差异显著；各试验组幼参的SR 变化在67.74％-95.56％，20％黄粉虫替代组、40％黄粉虫替代组、60％黄粉虫替代组及对照组的SR彼此差异均不显著，而80％黄粉虫替代组的刺参sR显著高于前4组。

2、黄粉虫粉替代鱼粉对刺参消化酶活性的影响

从表3可见：随着黄粉虫粉替代鱼粉量的增加，幼参的4种消化酶活性呈现严格的递增趋势；并且所有黄粉虫粉替代鱼粉试验组的纤维素酶和脂肪酶活性均显著高于对照组；在蛋白酶活性这个指标中，只有80％组显著高于对照组，在淀粉酶活性这个指标中，也仅有60％组与80％组显著高于对照组，且8O％组的淀粉酶与蛋白酶活性极显著高于60％组，而二者的纤维素酶与脂肪酶活性差异并不显著。

3、黄粉虫粉替代鱼粉对刺参相关免疫酶活性的影响

从表4可见：刺参4种免疫酶的活性也与黄粉虫粉替代鱼粉量呈正相关关系。与对照组相比，20％组4种免疫酶活性均显著低于对照组，而其他黄粉虫替代鱼粉组的AKP和T—SOD活性及80％组的ACP活性均极显著地高于对照组；60％组与80％组的LSZ活性显著高于对照组、20％组和40％组。值得注意的是，黄粉虫替代鱼粉各组的ACP、AKP和T-SOD活性彼此间均差异显著，而80％组与其他3组的差异极为显著。

三、讨论

黄粉虫成熟幼虫含粗蛋白47.7％～54.25％，粗脂肪23.3％～37.64％，并含有丰富的限制性氨基酸，蛋白质营养价值较高，必需氨基酸指数和必需氨基酸赖氨酸、蛋氨酸及苏氨酸的化学评分均高于豆粕和膨化大豆，苏氨酸的化学评分高于蝇蛆粉和蚕蛹而接近鱼粉，超过了联合国粮农组织/世界卫生组织(FAO/WHO)提出的必需氨基酸占氨基酸总量的40％ 的标准。并且黄粉虫幼虫脂肪酸质量和微量元素含量均优于鱼粉，无机元素Ca、Mg、Fe、Mn、Zn、Cu及维生素A和维生素E含量均高于其他肉类和鱼虾类中的含量。所以黄粉虫幼虫在多种动物的饲养中均取得了较好的效果。研究中，用20％、40％、60％和80％ 黄粉虫粉替代鱼粉均能显著提高幼刺参的SGR和SR，并且随着黄粉虫替代鱼粉量的递增，与对照组的差异越来越显著；刺参消化酶的活性同样与黄粉虫替代鱼粉的量成正相关，80％黄粉虫替代鱼粉组的各种消化酶活性极显著高于对照组。这可能是由于黄粉虫气味鲜美且浓郁，具有很强的诱食功能，能刺激幼参消化液的分泌，尤其是极大地促进了纤维素酶与脂肪酶活性的提高，从而增加了刺参的采食量，提高了幼参的生长速度。

刺参属于无脊椎动物，它的免疫系统是非特异性的，无论是在刺参的体壁防御还是体内免疫中，LSZ、ACP、AKP及SOD都发挥着重要的生理作用，作为刺参的4种主要的机体免疫因子，LSZ、ACP、AKP及SOD的活性变化可作为评价刺参免疫机能状态的重要指标。以往的研究发现，黄粉虫幼虫体内存在的抗肿瘤细胞K562的抗菌肽对K562细胞的增殖抑制作用明显优于羟基脲；黄粉虫抗菌肽Te。necin纯化蛋白对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、痢疾志贺氏菌和真菌均有抑制作用，尤其是对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强；黄粉虫幼虫血淋巴抗菌肽对猪致病性大肠杆菌和猪链球菌具有较强的抑菌活性；而且黄粉虫蛋白具有增加小鼠免疫器官质量、增强小鼠细胞免疫、激活和增强单核巨噬细胞功能及刺激B淋巴细胞产生抗体的作用。试验中，20％黄粉虫替代鱼粉组4种免疫酶的活性均显著低于对照组，但随着黄粉虫替代鱼粉量的递增，幼参ACP、AKP及T—SOD活性也呈现严格的递增趋势；且黄粉虫粉以超过40％ 的比例替代鱼粉时，幼刺参的AKP和SOD活性显著高于对照组；黄粉虫粉以超过60％的比例替代鱼粉时，幼刺参的LSZ的活性明显增强；只有黄粉虫以80％的比例替代鱼粉时，幼参的LSZ、ACP、AKP和T-SOD活性极显著高于其他组，这也许是保证80％黄粉虫替代鱼粉组幼参的SR显著高于其他组的一个主要因素。这也表明用黄粉虫粉替代鱼粉除了能够满足幼参的营养需要外还具有鱼粉不具备的优势，黄粉虫幼虫粉及其蛋白提取物有望成为新一代的抗生素替代品，有很好的应用前景。

试验研究发现，饲料中以80％ 黄粉虫粉替代鱼粉可极显著地诱导刺参消化酶及体内免疫相关酶活性的提高，明显增强刺参的健康水平，促进刺参的生长。并且随着黄粉虫粉替代鱼粉比例的增加，各试验组刺参均未出现免疫抑制现象，这为以后研究在饲料中以更大比例的黄粉虫粉替代鱼粉对刺参的影响奠定了基础。

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