木糖筛选系统在蔬菜遗传转化上的应用

转化效率低和转基因食品安全性问题一直是制约蔬菜基因工程育种的2个主要因素。在植物的遗传转化中，人们将植物细胞对不同糖类分解代谢能力的差异，作为筛选剂的正向选择系统得以发展，并在安全标记基因方面显示出巨大的应用潜力。

1、蔬菜遗传转化的研究现状及存在问题

随着植物基因工程技术的不断发展和完善，人们对蔬菜基因工程育种的研究日益增多，在蔬菜抗病、抗虫、改善品质及提高产量等方面取得了阶段性进展。

在目前的转基因技术中，对转化植株进行筛选往往采用抗性选择标记，如抗生素类或除草剂类抗性基因等。转基因植株一旦再生成功，这些抗性标记基因常与目的基因共转化并整合到植物基因组中，由此引发环境和食品安全性问题[1-2]；且在抗性选择剂的作用下，转化细胞成活下来，非转化细胞被杀死，因其在逐渐凋亡过程中能够分泌毒素或生长抑制剂，进而造成转基因体系的转化效率低[1]。鉴于这些情况，培育出转化效率高的生物安全标记基因的转基因植物，已成为目前基因工程的重要目标。

2、基于糖代谢相关基因的正向选择系统

2.1、糖代谢相关基因种类及选择优势

安全标记基因是对生态环境和人类健康相对安全的标记基因。研究较多的生物安全标记基因主要是与糖类代谢相关的基因，如磷酸甘露糖异构酶基因（pmi）、木糖异构酶基因（xylA）和核糖醇操纵子（rtl）等[3]。与糖代谢相关基因的转化系统不是将非转化细胞杀死，而是导入特定的基因使转化细胞具备特定的代谢优势或利用特定的物质，使之生长旺盛，从而达到筛选效果[4]。与常规标记基因不同，糖代谢相关基因具有以下优点：这些标记不具有抗性，基因本身及表达产物无毒副作用，因此不必担心环境安全和人类健康等问题；转化体系有利于植株再生，转化率高[5]。目前应用较多的是磷酸甘露糖异构酶基因，已广泛用于水稻、玉米、小麦、甜菜、棉花和番茄等植物转化系统[1]。近年来，木糖异构酶基因也得到初步应用。

2.2、木糖选择系统的筛选机理及应用

木糖异构酶基因（xylose isomerase gene，xylA），来源于红色链霉菌、高温厌氧芽孢杆菌，编码木糖异构酶基因，能催化D-木糖与D-木酮糖的互变异构（图1）[6]。

许多植物细胞可利用木酮糖作为主要碳源，但不能利用木糖。在含木糖的筛选培养基上，整合有外源xylA基因的细胞产生木糖异构酶能催化木糖异构为D-木酮糖，经磷酸戊糖途径分解代谢，为转化细胞生长所利用，而非转化细胞则因碳饥饿而不能正常生长[7]。用食品工业中常用的木糖作为植物转化细胞的筛选标记是安全的。

Haldrup等[8]首先应用D-木糖作为选择剂在烟草遗传转化上获得成功。韦正乙应用来源于大肠杆菌的木糖异构酶基因作为选择标记基因，建立了农杆菌介导的基于木糖选择系统的百脉根转化体系。实验对比了木糖筛选系统和除草剂筛选系统，在时间方面，木糖选择系统获得转基因再生苗要比除草剂筛选系统缩短10 d以上[9]。

3、木糖筛选系统在蔬菜遗传转化上的应用

以木糖作为筛选剂的无抗性选择标记技术是目前转基因研究的前沿。自1995年Vieille等[10]成功克隆并表达了木糖异构酶基因后，以木糖作为筛选剂的遗传转化已在多种粮食作物上得到深入研究，但在蔬菜上的应用却十分有限。

Haldrup等[8]将木糖异构酶基因通过农杆菌介导，成功地转化到马铃薯、番茄的愈伤组织中，然后将愈伤组织置于含有木糖的培养基中进行筛选，得到了能在该培养基中正常生长的转基因植株。应用木糖作为筛选剂的转化效率大致为18%～32%，明显高于应用卡那霉素筛选的转化率（4%～6%）。Haldrup等[11]最终确定以木糖作为筛选剂在番茄上进行遗传转化的碳源最佳配方为不含蔗糖，且D-木糖浓度为15 g/L，应用此配比的转化率可达9%，而用抗性标记选择的转化率仅为7%；马铃薯最适筛选配比为蔗糖7.5 g/L、木糖3.75 g/L，应用此配比的转化效率比用卡那霉素作为选择标记时高9倍，转基因植株中木糖异构酶活性为非转基因植株的5 ～25倍[12]。在不同作物中，木糖的筛选浓度有所差别，且转化率也有不同。

崔丽巍[13]以大肠杆菌xylA作为选择标记基因，利用木糖作为选择剂获得能够表达带有GUS报告基因的转基因黄瓜，同时还构建了pX390-scFv载体，初步建立了农杆菌介导的基于木糖选择系统的黄瓜转化体系。最终确定选择在培养基中加入 15 g/L 的木糖和 15 g/L的蔗糖，能获得较高的转化效率。

4、小结与展望

近年来，以糖代谢相关基因作为选择标记的正向选择系统得以迅速发展，目前应用较多的是磷酸甘露糖异构酶基因，而木糖异构酶标记基因应用相对较少，但已证明在植物遗传转化上是安全、有效的。

目前，笔者已经成功构建基于木糖异构酶标记基因的植物表达载体，并在马铃薯上应用D-木糖成功进行了遗传转化，建立了一套安全且转化率高的马铃薯转基因体系。在此工作基础上，将着力建立辣椒、黄瓜等受基因型限制、转化效率低的蔬菜作物遗传转化体系，提高蔬菜作物遗传转化效率，缓解因转基因食品安全性问题带来的困境，促进蔬菜基因工程育种工作健康发展。

参考文献

[1] 王彩芬.植物遗传转化中选择标记基因的研究进展[J].现代农业技术，2009（2）：6-10.

[2] 孙艳，戴绍军， 魏建华，等.转基因植物标记基因安全性研究进展[J].现代农业技术，2012（3）：17-20.

[3] 郭新梅，张晓东， 梁荣奇，等.以木糖异构酶基因为筛选标记的玉米遗传转化[J].植物生理与分子生物学学报，2007，33（6）：547-552.[4] 毛萍，蒋彬， 马欣荣，等.木糖对多年生黑麦草愈伤组织生长的影响[J].草业科学，2011，28（5）：758-762.

[5] 孙磊，张国军， 闫爱玲，等.木糖异构酶基因xylA的克隆及其表达载体的构建[J].生物技术通报，2011（7）：167-170.

[6] 王烨，顾兴芳.无抗性选择标记转基因技术在蔬菜作物上的应用[J].中国蔬菜，2011（12）：1-9.

[7] 阎淑滑，周波， 赵霞，等.以木糖异构酶基因xylA为选择标记的Gateway系统植物表达载体的构建[J].生物技术通讯，2010，21（1）：35-38.

[8] Haldrup A，Petersen S G， Okkels F T. The xylose isomerase gene from themoanaerobac- terium themosulfurogenes allows effective selection of transgenic plant cells using D-xylose as the selection agent[J].Plant Mol Biol，1998， 37：287-296.

[9] 韦正乙.利用木糖选择系统获得HAL1转基因百脉根植株及耐盐性鉴定[D].长春：东北师范大学，2007.

[10] Vieille C，Hess J M， Kelly R M，et al.xylA coling and sequeneing and biochemical characterization of xylose isomerase from thermotoga neapolitana [J].Appl Environ Microbiol，1995，61（5）：1867-1875.

[11] Haldrup A，Petersen S G， Okkels F T.Positive selection： a plant selection principle based on xylose isomerase，an enzyme used in the food industry[J]. Plant Cell Reports，1998，18：76-81.

[12] Haldrup A， Noerremark M， Okkels F T.Plant selection principle based on xylose isomerase[J]. In Vitro Cellular and Development Biology - Plant，2001，37（ 2）：114-119.

[13] 崔丽巍.木糖筛选系统在黄瓜转化中的应用[D].长春：东北师范大学，2010.